花生芽中6-苄基腺嘌呤的测定方法研究

  建立了高效液相色谱法测定花生芽中6-苄基腺嘌呤含量的方法。6-苄基腺嘌呤的检测波长为267nm;流动相为甲醇-20mmol/L乙酸铵溶液(50:50,v/v);前处理的提取方式为超声波提取法;高效液相色谱法测定花生芽中6-苄基腺嘌呤含量的在1-50mg/L范围线.82%,用该方法测定花生芽中6-苄基腺嘌呤含量的回收率在90%以上。

  6-苄基腺嘌呤(6-Benzylaminopurine)分子式是C12H11N5,分子量为225.25,熔点:230℃,形状为白色晶体,难溶于水,微溶于乙醇等有机溶剂,易溶于酸和碱且性质稳定。6-苄基腺嘌呤是一种人工合成的细胞分裂素,主要用于促进细胞分裂、细胞增大、种子发芽和果实生长等,我国曾经允许在豆芽生产上的应用。6-苄基腺嘌呤作为植物生长调节剂,其安全性目前没有结论,并且缺乏食品添加剂工艺必要性,目前我国的标准GB2760已经禁止6-苄基腺嘌呤作为食品用加工助剂生产经营和使用。

  6-苄基腺嘌呤更多的报道是关于在豆芽生产中的应用,俗称的“无根粉”主要成分就是6-苄基腺嘌呤,对于花生芽不管是生产方面或者是检测方面报道较少。花生芽被认为一种食疗兼备的食品,营养丰富,并富含维生素及各种氨基酸和微量元素,花生芽的生产和销售越来越普遍,对花生芽的各项指标的检测方法有研究的意义。

  6-苄基腺嘌呤的检测方法主要是光谱法和色谱法,光谱法灵敏度不够,基质干扰大,色谱法具有准确、高效、快速的特点。本论文研究高效液相色谱法测定花生芽中6-苄基腺嘌呤含量的方法,为花生芽中6-苄基腺嘌呤的检测提供技术参数。

  仪器及材料高效液相色谱仪:LC20AD(日本岛津公司);色谱柱:C18柱(250mm×4.6m,美国waters公司);电子分析天平(日本岛津公司);微波炉(美的公司);离心机(sigma公司);超纯水系统(德国Millipore公司);刀片式均质器(德国IKA公司);超声波提取器(上海比朗)。

  6-苄基腺嘌呤标准品纯度均大于99%(德国Dr.Erenstorfer公司);甲醇(色谱纯,美国CNW公司);乙酸铵(分析纯,国药集团化学试剂有限公司)。

  仪器条件流动相:甲醇:20mmol/L乙酸铵溶液(50:50,v/v),等度洗脱。流速:1.0mL/min;色谱柱温度:40℃;检测器:二极管阵列检测器,波长267nm;进样量:20L。

  检测波长的确定二极管阵列检测器能从190nm到900nm的全波段检测,要检测6-苄基腺嘌呤首先要确定其检测波长。配制6-苄基腺嘌呤的标准溶液,浓度为10.0mg/L,上机测定,从测定结果的光谱色谱三维图发现在5.8分钟有明显的响应,提取该时间点的吸收光谱图,结果见图1。

  图1中发现在210nm及267nm处均有吸收顶点,210nm处受到的干扰较大,因此选择267nm为6-苄基腺嘌呤的检测波长。流动相的选择选择纯甲醇、甲醇-20mmol/L乙酸铵溶液(50:50,v/v)和甲醇-水(50:50,v/v)三种不同体系的流动相作比较,流速均为为1.0mL/min,进样浓度为1.0mg/L的6-苄基腺嘌呤标准溶液,结果见图2。

  从图2中,1号为纯甲醇流动相的色谱图,峰形不对称,出峰时间过早有可能与其他杂质重合或者分离不好;3号为甲醇-水(50:50,v/v)流动相的色谱图,峰形对称但是峰展宽较大;2号为甲醇-20mmol/L乙酸铵溶液(50:50,v/v)流动相的色谱图,峰形对称并且峰展宽小,乙酸铵在流动相中有改善峰形的作用,因此选择甲醇-20mmol/L乙酸铵溶液(50:50,v/v)作为测定6-苄基腺嘌呤的流动相。样品前处理用甲醇提取花生芽中的6-苄基腺嘌呤,比较几种不同的提取方式,花生芽直接称样20.0g置于100mL的离心管中,加入50mL甲醇,用刀片式均质器均质2分钟。超声波提取:用超声波提取器提取30min;浸泡提取:在室温下放置10小时;微波提取:微波提取2分钟;各方法提取结束后冷却,5000r/min离心10分钟,取上层溶液过0.45m滤膜,上机测定,结果见表1。表中微波提取法虽然用时少,但是结果偏低,可能的原因是提取时间不足或者是6-苄基腺嘌呤分解了,超声波提取效率高,因此选择超声波提取法提取花生芽中的6-苄基腺嘌呤。方法学验证线性关系及检出限配制6-苄基腺嘌呤的系列标准溶液,上机测定,高效液相色谱法6-苄基腺嘌呤在1-50mg/L的范围内呈良好的线,以基线噪声的三倍作为测定的检出限,6-苄基腺嘌呤的检出限为0.1mg/kg。精密度及回收率进样10.0mg/L的6-苄基腺嘌呤标准溶液,连续进样11次计算精密度,结果见表4,高效液相色谱法测定6-苄基腺嘌呤的精密度为1.82%,精密度符合测定的要求。取花生芽样品,称样20.0g,添加6-苄基腺嘌呤标准溶液作为回收率的测试,按照3.3的前处理方法处理花生芽样品,回收率实验结果见表4。高效液相色谱法测定6-苄基腺嘌呤的回收率在90%以上,满足分析要求。建立了高效液相色谱法测定花生芽中6-苄基腺嘌呤含量的方法。通过提纯光谱,确定选择267nm为6-苄基腺嘌呤的检测波长;通过比较,选择甲醇-20mmol/L乙酸铵溶液(50:50,v/v)作为检测6-苄基腺嘌呤的流动相,流动加入乙酸铵能够很好地改善峰形;研究了前处理的提取方式,选择超声波提取法提取花生芽中的6-苄基腺嘌呤;对方法进行验证,高效液相色谱法测定花生芽中6-苄基腺嘌呤含量的在1-50mg/L范围线.82%,用该方法测定花生芽中6-苄基腺嘌呤含量的回收率在90%以上。高效液相色谱法测定花生芽中6-苄基腺嘌呤含量的方法准确,高效,可满足检测技术要求。[1]沙红,高燕,杨洪泽,等.6-苄基腺嘌呤对甜菜种子萌发的影响[J].中国糖料,2015,(4):28-29,32.[2]李小平,陈晓红,姚浔平,等.HPLC法测定豆芽中6-苄基腺嘌呤残留研究[J].中国卫生检验杂志,2005,(2):149-150,159.廖建萌曾丹丹黄国方湛江市食品药品检验所

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